Unidad de Cristalografía de Proteínas (PXF)

El propósito de la PXF del Institut Pasteur de Montevideo, es proveer equipamiento, entrenamiento, asistencia e innovaciones tecnológicas para determinar la estructura tridimensional de proteínas y otras macromoléculas o complejos macromoleculares. La PXF inicia sus actividades en setiembre de 2006. Luego de un período inicial de puesta a punto y control, la Unidad será operacional al cabo del primer trimestre de 2007.

La cristalografía de rayos X es una de las técnicas más poderosas para estudiar las estructuras tridimensionales de macromoléculas, y ha transformado nuestra comprensión de los procesos biológicos. Fue la difracción de rayos X que permitió, hace 50 años, descubrir la estructura de la doble hélice de ADN y descifrar las bases de su replicación. Más recientemente, se resolvió a escala atómica la estructura del ribosoma, una compleja estructura macromolecular de ARN y proteínas, revelando la mecánica de la biosíntesis de proteínas así como el mecanismo de acción de antibióticos importantes que actúan inhibiendo la traducción del ARNm. Fruto de éstos y muchos otros avances en cristalografía macromolecular, resulta hoy indudable que el conocimiento de la estructura frecuentemente permite comprender el mecanismo de acción de las moléculas biológicas, eventualmente estableciendo bases racionales para la ingeniería de proteínas o para el diseño de inhibidores y fármacos.
La PXF prestará un soporte prioritario a los grupos de investigación que se irán incorporando progresivamente al Instituto. Así mismo, estará fuertemente comprometida con la comunidad científica de Uruguay y de los países de la región (Mercosur), en sintonía con la política general definida por el IP Montevideo.
La acción de la PXF estará íntimamente vinculada con objetivos de investigación fundamental, con la convicción de que las facilidades tecnológicas son productivas en el contexto de un ambiente científico estimulante. En un comienzo las interacciones científicas serán más fuertes con el grupo del Investigador Principal, evolucionando rápidamente hacia los grupos de investigación que se incorporen al Instituto así como a colaboraciones externas.
La PXF definirá, de manera flexible, el mejor modo de uso de la plataforma con los usuarios, dependiendo de las características de cada proyecto. El espectro irá desde usuarios completamente autónomos a los que se les asignará el acceso con un tiempo de uso, hasta un servicio completo garantizado por el personal de la PXF. Los precios del servicio se graduarán de manera proporcional.
Finalmente, se resalta que la PXF trabajará en estrecha coordinación con las otras unidades tecnológicas del IP Montevideo, aumentando así la capacidad para abordar eficazmente diferentes proyectos.

Servicios

Las condiciones de cristalogénesis serán rastreadas inicialmente usando métodos aleatorios conocidos ("sparse-matrix"), aunque significativamente acelerados gracias al uso de sistemas robóticos para el manejo de líquidos, optimizado para dispensar gotas de 50-100 nanolitros en forma automática. Esta tecnología permitirá aumentar el espacio de rastreo (directamente correlacionado con la tasa de éxito para encontrar condiciones de cristalización) y simultáneamente disminuir la cantidad de proteína necesaria, comparando con las técnicas manuales clásicas (resultando en un ahorro global de 10-40 veces en términos de cantidad de proteína).
Una vez que se identifiquen condiciones de cristalización iniciales, la optimización de las mismas se hará, tanto en forma manual como usando una estrategia automatizada en matriz. Se dispondrá de un amplio cuarto (40 m²) con temperatura controlada para guardar, visualizar y manipular cristales. También se dispondrá de facilidades convencionales de crio-cristalografía.

La determinación de estructuras se podrá realizar en el laboratorio usando técnicas modernas de difracción de rayos X sobre cristales individuales. Los juegos de datos serán obtenidos normalmente en condiciones criogénicas (~100°K). La PXF contará con un generador de rayos X de ánodo rotatorio capaz de producir una microfuente de luz, una óptica en multicapa para focalizar el rayo, y un detector de área de tipo placa de imagen. Un sistema de llenado automático del contenedor de nitrógeno líquido garantizará condiciones de máxima seguridad durante la colección de datos. Nuestros accesorios para el montado de cristales (soportes para las muestras y cabezas goniométricas), respetarán los mismos estándares usados en el sincrotón LNLS (Campinas-Brasil). La coordinación eficiente con el LNLS permitirá a los usuarios del IP Montevideo, el acceso a sincrotrón cuando sea requerido.

LA PXF dispondrá de modernas facilidades de computación para colectar, guardar y procesar los datos de difracción, así como para resolver estructuras, construcción de modelos, refinado y validación. Se instalará y mantendrá una variedad importante de programas académicos para este fin.

Instalaciones y equipamiento

Sala de Crisalogénesis (~40 m²)

La temperatura será mantenida constante a 21 ºC con una presición de 0,5 ºC. Temperaturas alternativas de 4 y 30 ºC serán posibles con el uso de incubadoras. La sala estará equipada con los siguientes instrumentos

• Un robot dispensador de líquidos estará disponible durante 2007. El mismo será capaz de dispensar gotas en el rango del nanolitro para rastreo “high-throughput” de condiciones de cristalización en placas de 96 pocillos.
• Microscopios estereoscópicos Olympus (un trinocular SZX-16 y un binocular SZ-1145) para la visualización y manipulación de cristales. Los mismos están equipados con iluminación por fibra óptica.

SZX-16 SZ-1145

• Herramientas convencionales de criocristalografía como: bucles, bases magnéticas, viales, microherramiebtas de manipulación; termos de almacenaje y transporte en seco; etc.
  
  

Sala de Difracción de rayos X (~35 m²)

• Un sistema completo de difracción de rayos X permitirá colectar datos usando tecnología de punta. El sistema está optimizado para cristales de macromoléculas, pudiendo usarse tanto a temperatura ambiente como bajo condiciones criogénicas (disponible en octubre de 2006).
  Especificaciones de los equipos.
• Generador de rayos X Micromax007-HF (Rigaku), con una microfuente de rayos X (70μm) y ánodo rotatorio de Cu, dos puertos, sistema de enfriamiento por agua helada; óptica Varimax-HF (Osmic) con espejos multicapa; controlador de flujo laminar de nitrógeno gaseoso Cryostream Series 700 (Oxford Cryosystems) , equipado con un aparato de auto-llenado; detector de área tipo placa de imagen (image plate) de 345mm Mar345dtb (Mar Research)
  
  MicroMax007-HF

  
  Varimax-HF mirrors

  
  Mar345dtb plate detector

   
• 
  Los requerimientos para criocristalografía serán cubiertos con un generador de nitrógeno líquido LN-40 (Rigaku) (máxima generación de flujo de 40 lts/día) el cual será ubicado en una sala separada en el subsuelo. El LN-40 genera nitrógeno líquido a partir del aire.
  

Recursos Informáticos

• Cuatro estaciones Linux (doble procesador AMD 3.7MHz, 2Gb RAM, monitores planos de 19”, 240Gb SATA HD, tarjeta gráfica 256Mb nvidia Quadro FX 1100).
• Instalación y mantenimiento regular del conjunto de programas de cristalografía: XDS, MOSFLM, CNS, CCP4, Phenix, BnP, Solve/Resolve, SHELX C/D/E/L, Phaser, Sharp, O, Coot, Arp/wArp, Pymol, Raster3D, Molscript, entre las más importantes.
• Acceso completo a un backup central y servidor de discos RAID, conexión NFS.
• El apoyo institucional para expandir esta infraestructura inicial será brindado de acuerdo a la evolución de necesidades.