Servicio de secuenciación.

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La UBM proveerá de las tecnologías corrientes en biología molecular, con especial énfasis en aquellas aplicadas a medicina molecular. La UBM cuenta con un servicio de secuenciación automática de ácidos nucleicos y un servicio de análisis de fragmentos. Para ellos utiliza la siguiente tecnología:

Equipo:

El servicio de secuenciación cuenta con un secuenciador automático de 4 capilares, ABI3130 (Applied Biosystems). (Más info)

Método de secuenciación

Método enzimático de Sanger
Este método de secuenciación de ADN fue diseñado por Sanger, Nicklen y Coulson también en 1977 y se conoce como método de los terminadores de cadena o dideoxi.
Para este método resulta esencial disponer de un ADN de cadena simple (molde) y un iniciador, cebador o "primer" complementario de una región del ADN molde anterior a donde va a iniciarse la secuencia. Este cebador se utiliza como sustrato de la enzima ADN polimerasa I que va a extender la cadena copiando de forma complementaria el molde de ADN.

Requerimientos:

El éxito de una reacción de secuencia se relaciona directamente con la calidad y cantidad del molde presente en la reacción (ya sea de un plásmido o de un producto de PCR), es por ello que es necesario atender los requerimientos para la obtención de buenos resultados.

Tanto para plásmidos como para productos de PCR se recomienda la purificación con kit comerciales (fermentas, invitrogene, amersham, quiagen, etcétera). En el caso de no contar con estos kits, es posible obtener de forma casera ácidos nucleicos de buena calidad, en la sección protocolos encontrará algunos que pueden serle de utilidad.

Es aconsejable que la muestra se encuentre diluída en agua mQ en las concentraciones que recomendamos:

Productos de PCR : 20 ng/uL
Plásmidos: 100 ng/uL
Fago: 1 ug/ul

La cuantificación del ADN puede realizarse mediante espectrofotometría (1 UA 260 nm = 50 ug/mL ADN doble cadena. En el caso de utilizar la espectrofotmetría para medir la concentración de ADN es recomendable medir la absorbancia de la muestra a 280 nm para determinar la pureza de la muestra, considerando relaciones Abs260/Abs280 > 1,8 como muestras de buena calidad.

La cuantificación también puede realizarse observando la intensidad de bandas en geles de agarosa y comparando contra estándares de concentración conocida (comúnmente se utilizan marcadores de peso molecular). En el caso de realizar geles de agarosa es recomendable enviar una foto del mismo adjunto al formulario de secuenciación.

En el caso de querer secuenciar productos de PCR es imprescindible la presencia de una banda única (preferiblemente) en geles de acrilamida teñidos con nitrato de plata ó en geles de agarosa.

Es importante la eliminación de dímeros de primes y productos inespecíficos que se generen en la reacción de PCR y que puedan interferir con la secuencia de interés. En el caso de no ser posible la obtención de bandas únicas debe recortarse la banda de interés de geles de agarosa y luego purificarla (ya sea mediante el uso de kits comerciales o siguiendo alguno de los protocolos que encontrará en esta página).

Protocolos:

La calidad del molde es crítico a la hora de obtener una secuencia de buena calidad. Para ello se recomienda la purificación del molde utilizando kits comerciales (principalmente los que utilizan columnas con membranas de silicagel que unen de forma reversible ácidos nucleicos).

Sin embargo, en el caso de no contar con la posibilidad de utilizar kits comerciales, es posible obtener molde apto para secuenciar utilizando los siguientes protocolos que ponemos a disposición en esta sección:

Protocolo de extracción ADN plasmídico

Purificación de ADN plasmídico para secuenciación automática

1. Partir de 2 ml de cultivo ON en LB-ampicilina (100 ug/ml), o antibiótico apropiado.
2. Centrifugar a 12000 rpm por 5 minutos. Remover el sobrenadante por aspiración con pipeta.
3. Resuspender el precipitado en 100 μl solución I + 1 μl RNase (10 mg/ml) y vortexear bien.
4. Agregar 200 μl solución II  fresca. Mezclar por inversión de tubos (15 veces). Dejar 5 minutos a temperatura ambiente.
5. Agregar 150 μl solución III. Mezclar por inversión de tubos (15 veces), y dejar 5 min a temperatura ambiente.
6. Centrifugar  a 12000 rpm 5 minutos.
7. Transferir 400 μl del sobrenadante a tubo nuevo de 1,5 ml y agregar 800 μl de etanol 100%. Mezclar por inversión.
8. Centrifugar a 12000 rpm 5 minutos. Remover el sobrenadante con pipeta.
9. Lavar el precipitado con 500 μl de etanol 75%. Centrifugar brevemente y retirar el sobrenadante con pipeta.
10. Dejar secar el precipitado y resuspender en 50 μl de H₂O. Incubar 30 minutos a temperatura ambiente.
11. Enviar a secuenciar 10 μl de la miniprep.

Solución I:      50 mM glucosa
                       25 mM Tris-Cl (pH 8)
                       10 mM EDTA (pH 8)
Preparar en recipientes de aproximadamente 100ml y autoclavar por 15 minutos a 1 atm. Guardar a 4 ºC.

Solución II:    0.2N NaOH (diluida en el momento de un stock 10N)
                       1% SDS

Solución III:   60 ml de acetato de potasio 5M
                       11,5 ml de ácido acético glacial
                       28,5 ml de H2O

Productos de PCR:

En el caso de productos de PCR, es imprescindible utilizar como molde una única banda, para ello recomendamos visualizar los productos de PCR en geles de acrilamida y tinción con nitrato de plata.
En algunos casos (PCR de alta eficiencia) no es necesario purificar el producto y alcanza una precipitación para quitar los primers no utilizados en la reacción. En casos excepcionales, puede realizarse la secuencia utilizando como molde el producto de PCR sin realizar ninguna purificación previa.

Formulario

Resultados:

Los resultados son enviados por correo electrónico. El usuario recibirá un correo electrónico con un archivo adjunto.

Este archivo se puede abrir con algunos programas que se pueden descargar gratuitamente desde la web. El archivo contiene el cromatograma con la secuencia obtenida.

Ejemplo:

Visualización de secuencia en Chromas.

Recomendamos los siguientes programas para visualizar y editar secuencias:

Sequence Scanner (https://products.appliedbiosystems.com)

Finch TV (http://www.geospiza.com/finchtv/)

Chromas (http://www.technelysium.com.au/chromas.html)

Bioedit (http://www.mbio.ncsu.edu/BioEdit/bioedit.html)

Tabla de primers:

La UBM cuenta con los siguientes primers universales de secuenciación:

Los primers M13 F y R permiten la secuenciación de insertos en el MCS (multie-cloning-site) dentro del gene lacZ de varios vectores de clonado (se detallan algunos en la tabla).

Contacto:

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Teléfono: 5258049 int. 125

Envío de muestras por correo:

Institut Pasteur de Montevideo
Unidad de Biología Molecular
Mataojo 2020
CP. 11400
Montevideo, Uruguay