Institut Pasteur Montevideo

Una gran parte de las preguntas científicas de hoy en día son respondidas a través de la utilización de tecnologías de punta. Las investigaciones biomédicas en el área molecular con un desafío post-genómico necesitan generalmente de la producción de proteínas puras, solubles, funcionales y en gran cantidad. Las fuentes naturales de proteínas raramente reúnen esto requisitos, por lo que la tecnología de producción de proteínas recombinantes aparece como un método de elección. La expresión en sistemas celulares es usada comúnmente para la producción primaria de proteínas, las cuales luego de su purificación y evaluación funcional, son puestas a la disposición de los distintos proyectos de investigación. La UPP contará con una tecnología de avanzada, puesta al servicio de la producción de proteínas recombinantes a través de sistemas de expresión procariotas y/o eucariotas. Esta unidad trabajará en estrecha coordinación y colaboración con la Unidad de Cristalografía de Proteínas y la Unidad de Biofísica de Proteínas intentando de esta manera generar respuestas a proyectos científicos de interés común. Los servicios de la UPP estarán abiertos a los grupos de investigación del IP Montevideo así como a otros grupos de Uruguay y de la región (Mercosur).

Objetivos de la UPP

OBJETIVO GENERAL:

Producir proteínas recombinantes solubles, funcionales y en cantidad suficiente para los diferentes estudios estructurales, químicos y/o biofísicos requeridos.

OBJETIVOS ESPECÍFICOS:

Automatización de un sistema de clonado génico en diferentes vectores de expresión.
Automatizar la evaluación de las condiciones óptimas en la expresión y purificación de proteínas recombinantes.
Generar estrategias de solubilización y/o re-solubilización para proteínas insolubles.

Servicios

Expresión de proteínas

Sistemas procariotas:

La UPP proveerá la tecnología necesaria para el clonado y el subclonado de los genes de interés en los diferentes sistemas de expresión bacterianos, así como el equipamiento preciso para determinar los niveles de expresión y de producción proteica. Serán usados diferentes medios en forma rutinaria, incluyendo sistemas dependientes de los promotores T7 y T5, con la presencia de distintas proteínas de fusión como NUS, MBP, GST, TRX, “taggs” de cola de Histidinas, o bien sistemas de co-expresión.

Sistemas Eucariotas:

Baculovirus: El sistema de expresión en vectores de Baculovirus es un sistema viral utilizado para expresar genes heterólogos de diferentes orígenes. La co-transfección del vector llevando la proteína de interés junto con el vector viral en células de Spodoptera frugiperda permite, en la mayor parte de los casos, una cantidad suficiente del producto requerido. La principal ventaja de este sistema es la obtención de la proteína con condiciones de plegamiento y modificaciones post-traduccionales propias de un sistema eucariota.

Levadura: La UPP dispondrá también de un sistema de expresión optimizado en la levadura Pichia pastoris. Este sistema ofrece varios beneficios con respecto a la producción en E. coli y/o en Baculovirus. Por una parte, es de fácil cultivo llegándose a una alta densidad celular, lo que permite altos niveles de expresión y facilidad de escalado. Por la otra, reúne algunas de las ventajas de expresión en células eucariotas (correcto plegamiento proteico y modificaciones post-traduccionales).

Células de mamíferos: Los cultivos de células de mamíferos se han convertido en los sistemas preferidos para la producción de proteínas recombinantes heterólogas en las aplicaciones clínicas. El gran problema de insolubilidad proteica en los sistemas de expresión clásicos (E. coli, Baculovirus, Levaduras) ha permitido el desarrollo de nuevas tecnologías dirigidas a optimizar la expresión proteica en células de mamíferos. La fabricación de fermentadores de última generación permite hoy en día obtener, la mayor parte de las veces, proteínas funcionales, solubles y en gran cantidad. La UPP dispondrá de sistemas de expresión en mamíferos, particularmente en la línea linfocitaria P3X63Ag8.653 (X-63).

Solubilización de proteínas

Optimización de las condiciones de expresión: La UPP dispondrá de diversos protocolos para mejorar la solubilización de proteínas a través de plataformas robóticas de fluidos. Por medio de esta tecnología se podrán explorar en muy poco tiempo distintos sistemas de expresión procariotas y eucariotas, junto a variadas condiciones de cultivo. Por ejemplo, diferentes condiciones de inducción y de temperatura, distintos medios y/o sistemas de co-expresión (chaperoninas, factores específicos de la proteína de interés, proteínas de fusión y/o ARNtArg).

Estudios de re-solubilización: Basándose en la misma tecnología robótica se pondrán a punto diferentes protocolos de re-solubilización para aquellas proteínas insolubles que contengan cuerpos de inclusión en sistemas procariotas o agregados insolubles en sistemas eucariotas.

Producción y purificación de proteínas en gran escala

Purificación de proteínas: El esquema de purificación será dependiente de la naturaleza de cada proteína en particular, sin embargo se pueden citar algunos procedimientos de rutina de la plataforma como sigue: Homogeneización y disrupción celular por “French press”, precipitación en sulfato de amonio y cromatografía líquida de baja y alta presión. Los sistemas cromatográficos tendrán flexibilidad para adaptarse ya sea a la purificación de varias proteínas en paralelo, y/o para una misma proteína, a diferentes condiciones de análisis (“scouting”). Se dispondrá de un conjunto de técnicas analíticas incluyendo distintas cromatografías de afinidad del tipo de la amilosa, heparina, proteínas particulares como anticuerpos, columnas de quelación de metales, entre otras; así como también columnas de intercambio iónico, interacción hidrofóbica, hidroxipatita y gel filtración.

Escalado de la producción de proteínas: La UPP tendrá la capacidad de aumentar la producción de las proteínas de interés con el objetivo de lograr cantidades de proteínas superiores al miligramo para aquellos proyectos que así lo requieran (típicamente el caso de los estudios estructurales y/o funcionales).

Equipamientos

Sistemas cromatográficos FPLC y HPLC.
Agitadores orbitales con temperatura controlada.
Homogenizador de alta presión.
Fermentadores eucariotas y procariotas.
Plataforma robótica para soluciones y líquidos.



		Unidad de Producción de Proteínas (UPP) Responsable: Pablo Oppezzo Contacto Personal Una gran parte de las preguntas científicas de hoy en día son respondidas a través de la utilización de tecnologías de punta. Las investigaciones biomédicas en el área molecular con un desafío post-genómico necesitan generalmente de la producción de proteínas puras, solubles, funcionales y en gran cantidad. Las fuentes naturales de proteínas raramente reúnen esto requisitos, por lo que la tecnología de producción de proteínas recombinantes aparece como un método de elección. La expresión en sistemas celulares es usada comúnmente para la producción primaria de proteínas, las cuales luego de su purificación y evaluación funcional, son puestas a la disposición de los distintos proyectos de investigación. La UPP contará con una tecnología de avanzada, puesta al servicio de la producción de proteínas recombinantes a través de sistemas de expresión procariotas y/o eucariotas. Esta unidad trabajará en estrecha coordinación y colaboración con la Unidad de Cristalografía de Proteínas y la Unidad de Biofísica de Proteínas intentando de esta manera generar respuestas a proyectos científicos de interés común. Los servicios de la UPP estarán abiertos a los grupos de investigación del IP Montevideo así como a otros grupos de Uruguay y de la región (Mercosur). Objetivos de la UPP OBJETIVO GENERAL: Producir proteínas recombinantes solubles, funcionales y en cantidad suficiente para los diferentes estudios estructurales, químicos y/o biofísicos requeridos. OBJETIVOS ESPECÍFICOS: Automatización de un sistema de clonado génico en diferentes vectores de expresión. Automatizar la evaluación de las condiciones óptimas en la expresión y purificación de proteínas recombinantes. Generar estrategias de solubilización y/o re-solubilización para proteínas insolubles. Servicios Expresión de proteínas Sistemas procariotas: La UPP proveerá la tecnología necesaria para el clonado y el subclonado de los genes de interés en los diferentes sistemas de expresión bacterianos, así como el equipamiento preciso para determinar los niveles de expresión y de producción proteica. Serán usados diferentes medios en forma rutinaria, incluyendo sistemas dependientes de los promotores T7 y T5, con la presencia de distintas proteínas de fusión como NUS, MBP, GST, TRX, “taggs” de cola de Histidinas, o bien sistemas de co-expresión. Sistemas Eucariotas: Baculovirus: El sistema de expresión en vectores de Baculovirus es un sistema viral utilizado para expresar genes heterólogos de diferentes orígenes. La co-transfección del vector llevando la proteína de interés junto con el vector viral en células de Spodoptera frugiperda permite, en la mayor parte de los casos, una cantidad suficiente del producto requerido. La principal ventaja de este sistema es la obtención de la proteína con condiciones de plegamiento y modificaciones post-traduccionales propias de un sistema eucariota. Levadura: La UPP dispondrá también de un sistema de expresión optimizado en la levadura Pichia pastoris. Este sistema ofrece varios beneficios con respecto a la producción en E. coli y/o en Baculovirus. Por una parte, es de fácil cultivo llegándose a una alta densidad celular, lo que permite altos niveles de expresión y facilidad de escalado. Por la otra, reúne algunas de las ventajas de expresión en células eucariotas (correcto plegamiento proteico y modificaciones post-traduccionales). Células de mamíferos: Los cultivos de células de mamíferos se han convertido en los sistemas preferidos para la producción de proteínas recombinantes heterólogas en las aplicaciones clínicas. El gran problema de insolubilidad proteica en los sistemas de expresión clásicos (E. coli, Baculovirus, Levaduras) ha permitido el desarrollo de nuevas tecnologías dirigidas a optimizar la expresión proteica en células de mamíferos. La fabricación de fermentadores de última generación permite hoy en día obtener, la mayor parte de las veces, proteínas funcionales, solubles y en gran cantidad. La UPP dispondrá de sistemas de expresión en mamíferos, particularmente en la línea linfocitaria P3X63Ag8.653 (X-63). Solubilización de proteínas Optimización de las condiciones de expresión: La UPP dispondrá de diversos protocolos para mejorar la solubilización de proteínas a través de plataformas robóticas de fluidos. Por medio de esta tecnología se podrán explorar en muy poco tiempo distintos sistemas de expresión procariotas y eucariotas, junto a variadas condiciones de cultivo. Por ejemplo, diferentes condiciones de inducción y de temperatura, distintos medios y/o sistemas de co-expresión (chaperoninas, factores específicos de la proteína de interés, proteínas de fusión y/o ARNtArg). Estudios de re-solubilización: Basándose en la misma tecnología robótica se pondrán a punto diferentes protocolos de re-solubilización para aquellas proteínas insolubles que contengan cuerpos de inclusión en sistemas procariotas o agregados insolubles en sistemas eucariotas. Producción y purificación de proteínas en gran escala Purificación de proteínas: El esquema de purificación será dependiente de la naturaleza de cada proteína en particular, sin embargo se pueden citar algunos procedimientos de rutina de la plataforma como sigue: Homogeneización y disrupción celular por “French press”, precipitación en sulfato de amonio y cromatografía líquida de baja y alta presión. Los sistemas cromatográficos tendrán flexibilidad para adaptarse ya sea a la purificación de varias proteínas en paralelo, y/o para una misma proteína, a diferentes condiciones de análisis (“scouting”). Se dispondrá de un conjunto de técnicas analíticas incluyendo distintas cromatografías de afinidad del tipo de la amilosa, heparina, proteínas particulares como anticuerpos, columnas de quelación de metales, entre otras; así como también columnas de intercambio iónico, interacción hidrofóbica, hidroxipatita y gel filtración. Escalado de la producción de proteínas: La UPP tendrá la capacidad de aumentar la producción de las proteínas de interés con el objetivo de lograr cantidades de proteínas superiores al miligramo para aquellos proyectos que así lo requieran (típicamente el caso de los estudios estructurales y/o funcionales). Equipamientos Sistemas cromatográficos FPLC y HPLC. Agitadores orbitales con temperatura controlada. Homogenizador de alta presión. Fermentadores eucariotas y procariotas. Plataforma robótica para soluciones y líquidos. Animales Transgénicos y de Experimentación Biofísica de Proteínas Bioinformática Biología Celular Biología Molecular Bioquímica y Proteómica Analíticas Cristalografía de Proteínas Producción de Proteínas
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Unidad de Producción de Proteínas (UPP)